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實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
(1)掌握幾種常用的細(xì)菌染色方法。
(2)初步了解細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征。
細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)主要分為球菌、桿菌和螺旋菌(圖)3-1)。除了細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等基本結(jié)構(gòu)外,一些細(xì)菌細(xì)胞還具有孢子、莢膜、鞭毛等特殊結(jié)構(gòu),是細(xì)菌分類鑒定的重要指標(biāo)。由于細(xì)菌細(xì)胞小而透明,在顯微鏡下直接觀察時(shí)難以識別,因此通常需要染色才能觀察形狀和結(jié)構(gòu)。生物染色染料主要包括堿性染料、酸性染料和中性染料。在中性、堿性或弱酸性溶液中,細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷,而堿性染料在電離時(shí)帶正電荷,因此很容易與細(xì)胞結(jié)合,使細(xì)菌著色。因此,堿性染料主要用于細(xì)菌染色。常用的堿性染料有美藍(lán)、晶紫、番紅、孔雀綠等。
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圖3-1細(xì)菌基本形態(tài)顯微照片a.球菌;b.桿菌;c螺旋菌細(xì)菌染色的方法有很多,以下是幾種常用的染色方法。
簡單的染色方法:一種用染料染色細(xì)菌的方法。該方法操作簡單方便,僅適用于觀察細(xì)菌列。
丹麥病理學(xué)家Hans Christian Gram它成立于1884年,是細(xì)菌學(xué)中很重要的鑒別染色方法。革蘭氏染色后,各種細(xì)菌可分為革蘭氏陽性細(xì)菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)兩類。其基本步驟分為:結(jié)晶紫初染、碘液體染、乙醇(或丙酮)脫色和番紅復(fù)染。一般認(rèn)為,革蘭氏染色原理與細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成有關(guān)。G+細(xì)胞壁肽聚糖層厚,脂質(zhì)少。乙醇脫色時(shí),肽聚糖會因脫水而縮小網(wǎng)孔,降低滲透性,從而保留晶體紫色-碘復(fù)合物在細(xì)胞膜上,細(xì)胞呈紫色;G-細(xì)胞壁肽聚糖層薄,脂質(zhì)多,乙醇溶解脂質(zhì),增加細(xì)胞壁滲透性,結(jié)晶紫色-碘復(fù)合物溶于細(xì)胞壁,番紅復(fù)染使細(xì)胞呈紅色。
芽孢染色法:芽孢是一種圓形或橢圓形的休眠結(jié)構(gòu),由某些細(xì)菌在其生長發(fā)育后期在細(xì)胞中形成(圖3-2a)。細(xì)菌孢子壁厚致密,透氣性低,不易著色。孢子染色法是根據(jù)孢子不易染色,一旦染色后難以脫色的特點(diǎn)設(shè)計(jì)的。在加熱條件下用堿性染料孔雀綠染色,使染料不僅進(jìn)入菌體,而且進(jìn)入孢子。進(jìn)入菌體的染料洗滌后脫色,孢子著色后難以洗滌脫色。當(dāng)用對比度較高的復(fù)染劑染色時(shí),孢子仍然保留初始染料的顏色,細(xì)菌被染成復(fù)染劑的顏色,使孢子和細(xì)菌容易區(qū)分。
莢膜染色法:莢膜是一種被細(xì)菌細(xì)胞包圍的粘性物質(zhì),由多糖、糖蛋白或肽組成。由于莢膜與染料的親和力弱,不易著色,通常采用負(fù)染色法染色,即菌體和背景著色,而莢膜不著色,在菌體周圍形成透明圈(圖)3-2b)。由于莢膜含水量高,生產(chǎn)過程中通常不需要熱固定,以免夾膜變形,影響觀察。鞭毛染色方法:細(xì)菌鞭毛非常細(xì),直徑一般為10~20nm,只能用電子顯微鏡觀察(圖)3-2c)。然而,如果使用特殊的鞭毛染色方法,也可以在普通光學(xué)顯微鏡下看到。鞭毛染色方法有很多,但其基本原理是相同的,即在染色前用媒體染料處理,使其沉積在鞭毛上,使鞭毛加厚,然后染色。
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圖3-2細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的顯微照片(引自)M.T.馬迪根)a細(xì)菌芽孢;b細(xì)菌莢膜;c.細(xì)菌鞭毛
【實(shí)驗(yàn)設(shè)備】
1菌種金黃色葡萄球菌(Staphy loccocus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)或自備菌種。
2.染色液和試劑草酸銨結(jié)晶紫、盧哥碘液、95%酒精、番紅、5%孔雀綠水溶液、繪畫墨水、硝酸銀染色液、二甲苯、柏油等。3.廢液缸、洗瓶、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡、小試管(75mm×10mm)、燒杯、滴管、玻片架、鑷子、吸水紙、記號筆等。
【實(shí)驗(yàn)步驟】
1簡單染色法
(1)涂片:在干凈無油膩的玻片中央放一小滴水,按照無菌操作方法(圖)3-3)用接種環(huán)挑選少量金黃色葡萄球菌或大腸桿菌菌種,與水滴完全混合,涂上極薄的細(xì)菌膜。注:細(xì)菌量應(yīng)適當(dāng),涂抹均勻,避免細(xì)菌過多導(dǎo)致涂層細(xì)胞積累,難以看到細(xì)菌的個(gè)體形式。
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圖3-3制備涂層的無菌操作過程a接種環(huán)滅菌;b.拔管塞;c管口滅菌;d.取菌種;e管口滅菌;f.塞管塞;g.涂布;h燃燒接種環(huán)
(2)干燥:讓涂層自然干燥或用吹風(fēng)機(jī)吹干。
(3)固定:手持玻片一端,讓菌膜向上,通過火焰兩三次(玻片背面不燙手為宜)。注意:涂層干燥后要加熱固定,避免因固定時(shí)間過長而損壞細(xì)胞形態(tài)。
(4)染色:將涂片放在玻片架上,加入適量草酸銨結(jié)晶紫色液染色(以覆蓋菌膜為宜)1~2min。
(5)水洗:倒入染色液,用洗瓶小水沖洗,直至涂片上的水無色。
(6)干燥:用吸水紙吸水,自然干燥或用吹風(fēng)機(jī)吹干。
(7)鏡檢:涂片完全干燥后鏡檢查,從低倍鏡到高倍鏡,用油鏡觀察。簡單染色法的操作流程見圖3-4。
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圖3-4簡單的細(xì)菌染色法(引自M.T.馬迪根)
2.革蘭氏染色法
(1)生產(chǎn):取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌斜培養(yǎng)物常規(guī)涂層、干燥、固定(同上)。注:應(yīng)選擇幼年培養(yǎng)物、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌24h。涂片宜薄,以免脫色不完全造成假陽性。
(2)初始染色:滴加結(jié)晶紫(適合覆蓋菌膜)染色1~2min,水洗。
(3)媒染:用碘液沖去殘水,用碘液覆蓋約1min,水洗。
(4)脫色:將玻璃傾斜。在白色背景下,用滴管和95%乙醇脫色,直到乙醇剛好無紫色。注:革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是乙醇脫色。如果脫色過多,革蘭氏陽性細(xì)菌可能染成假陰性;如果脫色時(shí)間過短,革蘭氏陰性細(xì)菌也可能染成假陽性。
(5)復(fù)染:用番紅液復(fù)染2min,水洗。
(6)鏡檢:干燥后,用油鏡觀察。
3。芽孢染色法
(1)制作:按常規(guī)方法將大芽孢桿菌涂片、干燥、固定(同上)。
(2)染色:在涂片上加入5%孔雀綠染色液,用木夾夾住載玻片一端,用微火加熱酒精燈上方,用染料蒸汽而不沸騰,并開始計(jì)時(shí)5min。注:加熱過程中不要讓染色液沸騰,及時(shí)補(bǔ)充染色液,不要讓涂層干燥。
(3)水洗:玻片冷卻后,用水輕輕沖洗,直到流出的水中沒有染色液。
(4)復(fù)染:用番紅液染色2min。
(5)水洗:用水洗去染色液。
(6)鏡檢:干燥后用油鏡觀察。4.莢膜染色法
(1)混合物:在干凈的載玻片上加入1滴墨水,挑選少量膠質(zhì)芽孢桿菌菌體與其充分混合。
(2)覆蓋玻璃:在混合物上放一個(gè)清潔的覆蓋玻璃,然后在覆蓋玻璃上放一張濾紙,輕輕壓下,吸收多余的細(xì)菌液體。注:不要產(chǎn)生氣泡,以免影響觀察。
(3)鏡檢:先用低倍鏡,再用高倍鏡觀察。
5.鞭毛染色法(硝酸銀染色法)
(1)菌種準(zhǔn)備:取經(jīng)活化的蘇云金桿菌。
(2)準(zhǔn)備載玻片:將載玻片在含有適量洗衣粉的水中煮沸20min,取出,用清水徹底清洗,瀝干后浸泡在95%乙醇中,用時(shí)取出燒在火焰上的酒精和可能殘留的油漬。(3)菌液制備:斜菌種數(shù)環(huán)于1~2mL在無菌水試管中,制成菌懸液。
(4)生產(chǎn):將細(xì)菌液滴在玻璃的一端,傾斜玻璃,使細(xì)菌液慢慢流向另一端,用吸水紙吸收玻璃下端多余的細(xì)菌液,室溫自然干燥。
(5)染色:涂片干燥后,滴入硝酸銀染色A液覆蓋3~5min,用蒸餾水沖洗A液。用B沖去殘水后再加液B液覆蓋涂層染色數(shù)秒至1min,當(dāng)涂層表面出現(xiàn)明顯的棕色時(shí),立即用蒸餾水沖洗。如果添加請?zhí)砑?。B液后顯色較慢,可用微火加熱,直至顯褐色時(shí)立即水洗。自然干燥。
(6)鏡檢:干燥后用油鏡觀察,可從玻片一端逐漸移動到另一端觀察。
【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】
1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
(1)繪制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的形態(tài)圖,并注明革蘭氏染色結(jié)果。
(2)繪制芽孢桿菌形態(tài)圖(表示芽孢位置)。
(3)畫鞭毛細(xì)菌的形態(tài)圖。
2.思考題
(1)革蘭氏染色時(shí),為什么特別強(qiáng)調(diào)菌齡不能太老,用老齡細(xì)菌染色會出現(xiàn)什么問題?
(2)觀察芽孢菌素、莢膜和鞭毛結(jié)構(gòu)時(shí)使用的菌齡有什么區(qū)別?(張應(yīng)烙)
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