多光子顯微鏡成像技術(shù)：多光子顯微鏡用于體內(nèi)神經(jīng)元成像的多種技術(shù)

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比,多光子顯微鏡(MPM)具有光學(xué)切片和深層成像等功能,這兩個(gè)優(yōu)勢極大地促進(jìn)了研究者們對于完整活體大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識。2019年,Jerome Lecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個(gè)方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)[1]。

想要將神經(jīng)元活動與復(fù)雜行為聯(lián)系起來,通常需要對大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像,這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素,雖然可以通過增加激光強(qiáng)度來解決散射問題,但這會帶來其他問題,例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度*好的方法是用更長的波長作為激發(fā)光。

另外,對于雙光子(2P)成像而言,離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)*大的深度限制因素,而對于三光子(3P)成像這兩個(gè)問題大大減小,但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多,所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高,它需要更快速的掃描,以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動;需要更高的脈沖能量,以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號。

復(fù)雜 的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來,需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布廣泛的神經(jīng)元的活動,大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激,要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學(xué),就需要MPM具備對神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力?？焖費(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。

單束掃描技術(shù)可以高速遍歷大視場(FOV)的神經(jīng)組織

使用MPM對神經(jīng)元進(jìn)行成像時(shí),通過隨機(jī)訪問掃描—即激光束在整個(gè)視場上的任意選定點(diǎn)上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元,這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維,還可以優(yōu)化激光束的掃描時(shí)間。隨機(jī)訪問掃描(圖1)可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器(AOD)來實(shí)現(xiàn),其原理是將具有一個(gè)射頻信號的壓電傳感器粘在合適的晶體上,所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵,激光束通過光柵時(shí)發(fā)生衍射。通過射頻電信號調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向,這樣使用1個(gè)AOD就可以實(shí)現(xiàn)一維橫向的任意點(diǎn)掃描,利用1對AOD,結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實(shí)現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問掃描。但是該技術(shù)對樣本的運(yùn)動很敏感,易出現(xiàn)運(yùn)動偽影。目前,快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描,由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動偽影而被廣泛的使用。

圖1 基于AOD的體內(nèi)新皮層L2 / 3神經(jīng)元的雙光子成像[2]

快速光柵掃描有多種實(shí)現(xiàn)方式,使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描,將振鏡和可調(diào)電動透鏡結(jié)合在一起進(jìn)行快速3D掃描,但可調(diào)電動透鏡由于機(jī)械慣性的限制在軸向無法快速進(jìn)行焦點(diǎn)切換,影響成像速度,現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器(SLM)代替。

遠(yuǎn)程聚焦也是一種實(shí)現(xiàn)3D成像的手段,如圖2所示。在LSU模塊中,掃描振鏡進(jìn)行橫向掃描, ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,通過調(diào)控M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差,還可以進(jìn)行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經(jīng)元成像,可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來擴(kuò)大FOV,但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大,無法快速移動以進(jìn)行快速軸向掃描,因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦、SLM和可調(diào)電動透鏡。

圖2 遠(yuǎn)程聚焦雙光子成像系統(tǒng)的示意圖[3]多束掃描技術(shù)可以同時(shí)對神經(jīng)元組織的不同位置進(jìn)行成像

該技術(shù)如圖3所示。對兩個(gè)遠(yuǎn)距離(相距大于1-2 mm)的成像部位,通常使用兩條獨(dú)立的路徑進(jìn)行成像(圖3C,D);對于相鄰區(qū)域,通常使用單個(gè)物鏡的多光束進(jìn)行成像(圖3E,F)。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_問題,這個(gè)問題可以通過事后光源分離方法或時(shí)空復(fù)用方法來解決。事后光源分離方法指的是用算法來分離光束消除串?dāng)_;時(shí)空復(fù)用方法指的是同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束,每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上延遲,這樣就可以暫時(shí)分離被不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號。引入越多路光束就可以對越多的神經(jīng)元進(jìn)行成像,但是多路光束會導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間的重疊增加,從而限制了區(qū)分信號源的能力;并且多路復(fù)用對電子設(shè)備的工作速率有很高的要求;大量的光束也需要更高的激光功率來維持近似單光束的信噪比,這會容易導(dǎo)致組織損傷。

圖3 大面積成像技術(shù)

近年來,不同的MPM技術(shù)的發(fā)展拓寬了我們對神經(jīng)組織的成像范圍,使得我們可以以更快的速度對大腦深處更多的神經(jīng)元進(jìn)行成像,這大大推動了神經(jīng)科學(xué)的研究,使我們能夠?qū)δX功能有更清晰的理解。

參考文獻(xiàn)

[1] Lecoq J, Orlova N, Grewe BF． Wide． Fast． Deep: Recent Advances in Multiphoton Microscopy of In Vivo Neuronal Activity[J]． The Journal of Neuroscience． 2019, 39(46): 9042–9052．

[2] Grewe BF, Langer D, Kasper H, Kampa BM, Helmchen F． High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision[J]． Nat Methods． 2010, 7:399-405．

[3] Botcherby EJ, Smith CW, Kohl MM, De?barre D, Booth MJ, Juskaitis R, Paulsen O, Wilson T． Aberration-free three-dimensional multiphoton imaging of neuronal activity at kHz rates[J]． Proc Natl Acad Sci USA． 2012, 109: 2919-2924．