光學(xué)顯微鏡（英文Optical Microscope，簡(jiǎn)寫OM）是利用光學(xué)原理，把人眼所不能分辨的微小物體放大成像，以供人們提取微細(xì)結(jié)構(gòu)信息的光學(xué)儀器。

　　介紹

　　顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器，已有300多年的發(fā)展史。自從有了顯微鏡，人們看到了過(guò)去看不到的許多微小生物和構(gòu)成生物的基本單元——細(xì)胞。不僅有能放大千余倍的光學(xué)顯微鏡，而且有放大幾十萬(wàn)倍的電子顯微鏡，使我們對(duì)生物體的生命活動(dòng)規(guī)律有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。在普通中學(xué)生物教學(xué)大綱中規(guī)定的實(shí)驗(yàn)中，大部分要通過(guò)顯微鏡來(lái)完成，因此，顯微鏡性能的好壞是做好觀察實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。

　　組成結(jié)構(gòu)

　　光學(xué)系統(tǒng)

　　顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)主要包括物鏡、目鏡、反光鏡和聚光器四個(gè)部件。廣義的說(shuō)也包括照明光源、濾光器、蓋玻片和載玻片等。

　?。ㄒ唬?、物鏡

　　物鏡是決定顯微鏡性能的*重要部件，安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上，接近被觀察的物體，故叫做物鏡或接物鏡。

　　物鏡的放大倍數(shù)與其長(zhǎng)度成正比。物鏡放大倍數(shù)越大，物鏡越長(zhǎng)。

　　1．物鏡的分類

　　物鏡根據(jù)使用條件的不同可分為干燥物鏡和浸液物鏡；其中浸液物鏡又可分為水浸物鏡和油浸物鏡（常用放大倍數(shù)為90—100倍）。

　　根據(jù)放大倍數(shù)的不同可分為 低倍物鏡（10倍以下）、中倍物鏡（20倍左右）高倍物鏡（40—65倍）。

　　根據(jù)像差矯正情況，分為消色差物鏡（常用，能矯正光譜中兩種色光的色差的物鏡）和復(fù)色差物鏡（能矯正光譜中三種色光的色差的物鏡，價(jià)格貴，使用少）。

　　2、物鏡的主要參數(shù)：

　　物鏡主要參數(shù)包括：放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑和工作距離。

　?、?、放大倍數(shù)是指眼睛看到像的大小與對(duì)應(yīng)標(biāo)本大小的比值。它指的是長(zhǎng)度的比值而不是面積的比值。例：放大倍數(shù)為100×，指的是長(zhǎng)度是1μm的標(biāo)本，放大后像的長(zhǎng)度是100μm，要是以面積計(jì)算，則放大了10,000倍。

　　顯微鏡的總放大倍數(shù)等于物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。

　?、?、數(shù)值孔徑也叫鏡口率，簡(jiǎn)寫NA 或A，是物鏡和聚光器的主要參數(shù)，與顯微鏡的分辨力成正比。干燥物鏡的數(shù)值孔徑為0.05-0.95，油浸物鏡（香柏油）的數(shù)值孔徑為1.25。

　?、邸⒐ぷ骶嚯x是指當(dāng)所觀察的標(biāo)本*清楚時(shí)物鏡的前端透鏡下面到標(biāo)本的蓋玻片上面的距離。物鏡的工作距離與物鏡的焦距有關(guān)，物鏡的焦距越長(zhǎng)，放大倍數(shù)越低，其工作距離越長(zhǎng)。例：10倍物鏡上標(biāo)有10/0.25和160/0.17，其中10為物鏡的放大倍數(shù)；0.25為數(shù)值孔徑；160為鏡筒長(zhǎng)度（單位mm）；0.17為蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度（單位 mm）。10倍物鏡有效工作距離為6.5mm，40倍物鏡有效工作距離為0.48mm 。3、物鏡的作用是將標(biāo)本作**次放大，它是決定顯微鏡性能的*重要的部件——分辨力的高低。

　　分辨力也叫分辨率或分辨本領(lǐng)。分辨力的大小是用分辨距離（所能分辨開的兩個(gè)物點(diǎn)間的*小距離）的數(shù)值來(lái)表示的。在明視距離（25cm）之處，正常人眼所能看清相距0.073mm的兩個(gè)物點(diǎn)，這個(gè)0.073mm的數(shù)值，即為正常人眼的分辨距離。顯微鏡的分辨距離越小，即表示它的分辨力越高，也就是表示它的性能越好。

　　顯微鏡的分辨力的大小由物鏡的分辨力來(lái)決定的，而物鏡的分辨力又是由它的數(shù)值孔徑和照明光線的波長(zhǎng)決定的。

　　當(dāng)用普通的中央照明法（使光線均勻地透過(guò)標(biāo)本的明視照明法）時(shí)，顯微鏡的分辨距離為d=0.61λ/NA

　　式中d——物鏡的分辨距離，單位 nm。

　　λ——照明光線波長(zhǎng)，單位 nm。

　　NA ——物鏡的數(shù)值孔徑

　　例如油浸物鏡的數(shù)值孔徑為1.25，可見光波長(zhǎng)范圍為400—700nm ，取其平均波長(zhǎng)550 nm，則d=270 nm，約等于照明光線波長(zhǎng)一半。一般地，用可見光照明的顯微鏡分辨力的極限是0.2μm。

　?。ǘ?、目鏡因?yàn)樗拷^察者的眼睛，因此也叫接目鏡。安裝在鏡筒的上端。

　　1．目鏡的結(jié)構(gòu)

　　通常目鏡由上下兩組透鏡組成，上面的透鏡叫做接目透鏡，下面的透鏡叫做會(huì)聚透鏡或場(chǎng)鏡。上下透鏡之間或場(chǎng)鏡下面裝有一個(gè)光闌（它的大小決定了視場(chǎng)的大?。?yàn)闃?biāo)本正好在光闌面上成像，可在這個(gè)光闌上粘一小段毛發(fā)作為指針，用來(lái)指示某個(gè)特點(diǎn)的目標(biāo)。也可在其上面放置目鏡測(cè)微尺，用來(lái)測(cè)量所觀察標(biāo)本的大小。

　　目鏡的長(zhǎng)度越短，放大倍數(shù)越大（因目鏡的放大倍數(shù)與目鏡的焦距成反比）。

　　2．目鏡的作用

　　是將已被物鏡放大的，分辨清晰的實(shí)像進(jìn)一步放大，達(dá)到人眼能容易分辨清楚的程度。

　　常用目鏡的放大倍數(shù)為5—16倍。

　　3．目鏡與物鏡的關(guān)系物鏡已經(jīng)分辨清楚的細(xì)微結(jié)構(gòu)，假如沒(méi)有經(jīng)過(guò)目鏡的再放大，達(dá)不到人眼所能分辨的大小，那就看不清楚；但物鏡所不能分辨的細(xì)微結(jié)構(gòu)，雖然經(jīng)過(guò)高倍目鏡的再放大，也還是看不清楚，所以目鏡只能起放大作用，不會(huì)提高顯微鏡的分辨率。有時(shí)雖然物鏡能分辨開兩個(gè)靠得很近的物點(diǎn)，但由于這兩個(gè)物點(diǎn)的像的距離小于眼睛的分辨距離，還是無(wú)法看清。所以，目鏡和物鏡即相互聯(lián)系，又彼此制約。

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　　聚光器也叫集光器。位于標(biāo)本下方的聚光器支架上。它主要由聚光鏡和可變光闌組成。其中，聚光鏡可分為明視場(chǎng)聚光鏡（普通顯微鏡配置）和暗視場(chǎng)聚光鏡。

　　1．光鏡的主要參數(shù)

　　數(shù)值孔徑（NA ）是聚光鏡的主要參數(shù)，*大數(shù)值孔徑一般是1.2—1.4，數(shù)值孔徑有一定的可變范圍，通?？淘谏戏酵哥R邊框上的數(shù)字是代表*大的數(shù)值孔徑，通過(guò)調(diào)節(jié)下部可變光闌的開放程度，可得到此數(shù)字以下的各種不同的數(shù)值孔徑，以適應(yīng)不同物鏡的需要。有的聚光鏡由幾組透鏡組成，*上面的一組透鏡可以卸掉或移出光路，使聚光鏡的數(shù)值孔徑變小，以適應(yīng)低倍物鏡觀察時(shí)的照明。

　　2、聚光鏡的作用

　　聚光鏡的作用相當(dāng)于凸透鏡，起會(huì)聚光線的作用，以增強(qiáng)標(biāo)本的照明。一般地把聚光鏡的聚光焦點(diǎn)設(shè)計(jì)在它上端透鏡平面上方約1.25mm處。（聚光焦點(diǎn)正在所要觀察的標(biāo)本上，載玻片的厚度為1.1mm左右）

　　3．可變光闌

　　可變光闌也叫光圈，位于聚光鏡的下方，由十幾張金屬薄片組成，中心部分形成圓孔。其作用是調(diào)節(jié)光強(qiáng)度和使聚光鏡的數(shù)值孔徑與物鏡的數(shù)值孔徑相適應(yīng)。可變光闌開得越大，數(shù)值孔徑越大（觀察完畢后，應(yīng)將光圈調(diào)至*大）。

　　在可變光闌下面，還有一個(gè)圓形的濾光片托架。

　　說(shuō)明：在中學(xué)實(shí)驗(yàn)室只有教師用顯微鏡（1600×或1500×）才配有聚光器，學(xué)生用顯微鏡（640×或500×）配的是旋轉(zhuǎn)光欄。緊貼在載物臺(tái)下，能做圓周轉(zhuǎn)動(dòng)的圓盤，旋轉(zhuǎn)光欄（也稱為遮光器），光欄上有大小不等的圓孔，叫光圈。直徑分別為2、3、6、12、16mm,轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)光欄，光欄上每個(gè)光圈都可以對(duì)正通光孔，通過(guò)大小不等的光圈來(lái)調(diào)節(jié)光線的強(qiáng)弱。

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　　反光鏡是一個(gè)可以隨意轉(zhuǎn)動(dòng)的雙面鏡，直徑為50mm，一面為平面，一面為凹面，其作用是將從任何方向射來(lái)的光線經(jīng)通光孔反射上來(lái)。平面鏡反射光線的能力較弱，是在光線較強(qiáng)時(shí)使用，凹面鏡反射光線的能力較強(qiáng)，是在光線較弱時(shí)使用。

　　反光鏡通常一面是平面鏡，另一面是凹面鏡，裝在聚光器下面，可以在水平與垂直兩個(gè)方向上任意旋轉(zhuǎn)。

　　反光鏡的作用是使由光源發(fā)出的光線或天然光射向聚光器。當(dāng)用聚光器時(shí)一般用平面鏡，不用時(shí)用凹面鏡；當(dāng)光線強(qiáng)時(shí)用平面鏡，弱時(shí)用凹面鏡。

　　觀察完畢后，應(yīng)將反光鏡垂直放置。

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　　顯微鏡的照明可以用天然光源或人工光源

　　1．天然光源

　　光線來(lái)自天空，*好是由白云反射來(lái)的。不可利用直接照來(lái)的太陽(yáng)光。

　　2．人工光源

　?、佟?duì)人工光源的基本要求：有足夠的發(fā)光強(qiáng)度；光源發(fā)熱不能過(guò)多。

　?、?、常用的人工光源：顯微鏡燈；日光燈

　?。V光器

　　安裝在光源和聚光器之間。作用是讓所選擇的某一波段的光線通過(guò)，而吸收掉其他的光線，即為了改變光線的光譜成分或削弱光的強(qiáng)度。分為兩大類：濾光片和液體濾光器。

　?。ㄆ撸┥w玻片和載玻片

　　蓋玻片和載玻片的表面應(yīng)相當(dāng)平坦，無(wú)氣泡，無(wú)劃痕。*好選用無(wú)色，透明度好的，使用前應(yīng)洗凈。

　　蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度是0.17±0.02mm，如不用蓋玻片或蓋玻片厚度不合適，都會(huì)影響成像質(zhì)量。

　　載玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度是1.1±0.04mm，一般可用范圍是1—1.2mm，若太厚會(huì)影響聚光器效能，太薄則容易破裂。

　　機(jī)械裝置

　　顯微鏡的機(jī)械裝置是顯微鏡的重要組成部分。其作用是固定與調(diào)節(jié)光學(xué)鏡頭，固定與移動(dòng)標(biāo)本等。主要有鏡座、鏡臂、載物臺(tái)、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、與調(diào)焦裝置組成。

　?。ㄒ唬㈢R座和鏡臂

　　1．鏡座作用是支撐整個(gè)顯微鏡，裝有反光鏡，有的還裝有照明光源。

　　2．鏡臂作用是支撐鏡筒和載物臺(tái)。分固定、可傾斜兩種。

　　（二）、載物臺(tái)（又稱工作臺(tái)、鏡臺(tái)）

　　載物臺(tái)作用是安放載玻片，形狀有圓形和方形兩種，其中方形的面積為120mm×110mm。中心有一個(gè)通光孔，通光孔后方左右兩側(cè)各有一個(gè)安裝壓片夾用的小孔。分為固定式與移動(dòng)式兩種。有的載物臺(tái)的縱橫坐標(biāo)上都裝有游標(biāo)尺，一般讀數(shù)為0.1mm，游標(biāo)尺可用來(lái)測(cè)定標(biāo)本的大小，也可用來(lái)對(duì)被檢部分做標(biāo)記。

　　（三）、鏡筒

　　鏡筒上端放置目鏡，下端連接物鏡轉(zhuǎn)換器。分為固定式和可調(diào)節(jié)式兩種。機(jī)械筒長(zhǎng)（從目鏡管上緣到物鏡轉(zhuǎn)換器螺旋口下端的距離稱為鏡筒長(zhǎng)度或機(jī)械筒長(zhǎng)）不能變更的叫做固定式鏡筒，能變更的叫做調(diào)節(jié)式鏡筒，新式顯微鏡大多采用固定式鏡筒，國(guó)產(chǎn)顯微鏡也大多采用固定式鏡筒，國(guó)產(chǎn)顯微鏡的機(jī)械筒長(zhǎng)通常是160mm。

　　安裝目鏡的鏡筒，有單筒和雙筒兩種。單筒又可分為直立式和傾斜式兩種，雙筒則都是傾斜式的。其中雙筒顯微鏡，兩眼可同時(shí)觀察以減輕眼睛的疲勞。雙筒之間的距離可以調(diào)節(jié)，而且其中有一個(gè)目鏡有屈光度調(diào)節(jié)（即視力調(diào)節(jié)）裝置，便于兩眼視力不同的觀察者使用。

　?。ㄋ模⑽镧R轉(zhuǎn)換器

　　物鏡轉(zhuǎn)換器固定在鏡筒下端，有3—4個(gè)物鏡螺旋口，物鏡應(yīng)按放大倍數(shù)高低順序排列。旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器時(shí)，應(yīng)用手指捏住旋轉(zhuǎn)碟旋轉(zhuǎn)，不要用手指推動(dòng)物鏡，因時(shí)間長(zhǎng)容易使光軸歪斜，使成像質(zhì)量變壞。

　?。ㄎ澹?、調(diào)焦裝置

　　顯微鏡上裝有粗準(zhǔn)焦螺旋和細(xì)準(zhǔn)焦螺旋。有的顯微鏡粗準(zhǔn)焦螺旋與裝在同一軸上，大螺旋為粗準(zhǔn)焦螺旋，小螺旋為細(xì)準(zhǔn)焦螺旋；有的則分開安置，位于鏡臂的上端較大的一對(duì)螺旋為是粗準(zhǔn)焦螺旋，其轉(zhuǎn)動(dòng)一周，鏡筒上升或下降10mm。位于粗準(zhǔn)焦螺旋下方較小的一對(duì)螺旋為細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，其轉(zhuǎn)動(dòng)一周，鏡筒升降值為0.1mm，細(xì)準(zhǔn)焦螺旋調(diào)焦范圍不小于1.8mm。

　　使用方法

　　1．使用單筒顯微鏡時(shí)，要養(yǎng)成用左眼觀察的習(xí)慣（因一般用右手畫圖），觀察時(shí)要兩眼同時(shí)睜開，不要睜一只閉一只，因?yàn)檫@樣易于疲勞。為了訓(xùn)練學(xué)生習(xí)慣于兩眼同時(shí)睜開觀察，可剪一塊長(zhǎng)約14cm，寬約6cm的長(zhǎng)方形硬紙片，在靠近左端處挖一個(gè)直徑比鏡筒上端外徑略小的圓孔，把圓孔套在鏡筒上段，觀察時(shí)兩眼同時(shí)睜開，利用紙片的右端擋住右眼的視線，這樣訓(xùn)練一段時(shí)間后，就能習(xí)慣于兩眼同時(shí)睜開，然后把紙片去掉。

　　2．直筒顯微鏡的鏡臂與鏡座連接處，是一個(gè)機(jī)械關(guān)節(jié)，可用于調(diào)節(jié)鏡筒的傾斜度，便于觀察，鏡臂不能過(guò)于后傾，一般不超過(guò)40°。但是在使用臨時(shí)裝片觀察時(shí)，禁止使用傾斜關(guān)節(jié)（當(dāng)鏡筒傾斜時(shí)，載物臺(tái)也隨之傾斜，載玻片上的液體易流出），尤其是裝片內(nèi)含酸性試劑時(shí)嚴(yán)禁使用，以免污損鏡體。

　　3．目鏡和物鏡的使用

　　一般都是用一個(gè)放大倍數(shù)適中的目鏡（10×）和*低倍的物鏡開始觀察，逐步改用倍數(shù)較高的物鏡，從中找到符合實(shí)驗(yàn)要求的放大倍數(shù)。

　　轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)，先用低倍鏡觀察，調(diào)節(jié)到正確的工作距離（成像*清晰）。如果進(jìn)一步使用高倍物鏡觀察，應(yīng)在轉(zhuǎn)換高倍物鏡之前，把物像中需要放大觀察的部分移至視野中央（將低倍物鏡轉(zhuǎn)換成高倍物鏡觀察時(shí)，視野中的物像范圍縮小了很多）。低倍物鏡和高倍物鏡基本齊焦（同高調(diào)焦）。

　　通常認(rèn)為，使用任何一個(gè)物鏡時(shí)，有效放大倍數(shù)的上限是1，000乘它的數(shù)值孔徑，下限是250乘它的數(shù)值孔徑。如40×物鏡的數(shù)值孔徑是0.65，則上、下限分別為：1000×0.65=650倍和250×0.65≈163倍，超過(guò)有效放大倍數(shù)上限的叫做無(wú)效放大，不能提高觀察效果。低于下限的放大倍數(shù)則人眼無(wú)法分辨，不利于觀察。一般*實(shí)用的放大倍數(shù)范圍是500—700乘數(shù)值孔徑之間的數(shù)字。

　　4．油浸物鏡的使用

　　使用油浸物鏡時(shí)，一般不要使用同高調(diào)焦。同高調(diào)焦只適用于每臺(tái)顯微鏡的原配物鏡，在使用低倍和高倍物鏡時(shí)，是一個(gè)極有利的方便條件，但在使用油浸物鏡時(shí)，則受到一定限制，一般地說(shuō)，用油鏡觀察未加蓋玻片的標(biāo)本片（載玻片）時(shí)，利用同高調(diào)焦的安全度較大，而對(duì)于有蓋玻片的標(biāo)本片，要小心使用，因?yàn)橛徒镧R的工作距離很短，在設(shè)計(jì)和裝配時(shí)所考慮的同高是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)厚度蓋玻片的。

　　用油浸物鏡時(shí)，只在標(biāo)本片上滴香柏油。觀察完畢后，要及時(shí)進(jìn)行清潔工作，如不及時(shí)進(jìn)行，香柏油粘上灰塵，擦拭時(shí)灰塵粒子可能磨損透鏡，香柏油在空氣中暴露時(shí)間長(zhǎng)，還會(huì)變稠、變干，擦拭很困難，對(duì)儀器很不利。擦拭要細(xì)心，動(dòng)作要輕。油浸物鏡前端先用干的擦鏡紙擦一兩次，把大部分油去掉，再用二甲苯滴濕的擦鏡紙擦兩次，*后再用干的擦鏡紙擦一次。標(biāo)本片上的香柏油可用“拉紙法”（即把一小張擦鏡紙蓋在香柏油上，然后在紙上滴一些二甲苯，趁濕把紙往外拉，這樣連續(xù)三四次，即可干凈，一般不會(huì)損壞未加蓋玻片的涂片標(biāo)本）擦凈。擦鏡紙也要防塵，一般在使用前，將每頁(yè)剪成8小塊，貯存在一個(gè)干凈的小培養(yǎng)皿中，用起來(lái)既節(jié)省又方便。

　　5．聚光器的使用方法

　?、?、使用聚光器的原因

　　當(dāng)放大倍數(shù)增加時(shí)，一方面由于放大倍數(shù)越高，透鏡數(shù)目越多，被透鏡吸收的光線也越多；另一方面由于視場(chǎng)（指的是所能看到被檢標(biāo)本的范圍）的亮度與放大倍數(shù)的平方成反比，即放大倍數(shù)越高，視場(chǎng)越暗。為了得到足夠的亮度，必須安裝聚光器，把光線集中到所要觀察的標(biāo)本上。

　　②、觀察時(shí)聚光器應(yīng)處的高度

　　觀察時(shí)，要保證得到*好的觀察效果，聚光器的聚光焦點(diǎn)應(yīng)正好落在標(biāo)本上。要實(shí)現(xiàn)這個(gè)條件，就必須調(diào)節(jié)聚光器的高度。當(dāng)用平行光照明時(shí)，聚光器的聚光焦點(diǎn)是在它上端透鏡平面中心上方約1.25mm之處，因此，人們常常要求在觀察時(shí)將聚光器上升到它上端透鏡平面僅稍稍低于載物臺(tái)平面的高度，這樣聚光焦點(diǎn)就可能落到位于標(biāo)準(zhǔn)厚度載玻片上的標(biāo)本上。當(dāng)使用比標(biāo)準(zhǔn)厚度薄的載玻片來(lái)承放標(biāo)本時(shí)，聚光器的位置要相應(yīng)地降低一些，而當(dāng)使用過(guò)厚地載玻片時(shí)，聚光焦點(diǎn)只能落在標(biāo)本下方，不利于精細(xì)的觀察。

　?、?、聚光器與物鏡的配合

　　這里所謂的配合，就是使聚光器和物鏡這兩者的數(shù)值孔徑取得一致，以更好的進(jìn)行較為精細(xì)的觀察。假如聚光器的數(shù)值孔徑低于物鏡，那物鏡的部分?jǐn)?shù)值孔徑就浪費(fèi)了，從而達(dá)不到它的*高分辨力。假如把聚光器的數(shù)值孔徑大于物鏡的數(shù)值孔徑，則一方面不能提高物鏡的規(guī)定分辨力，另一方面反會(huì)由于照明光束過(guò)寬，使物象的清晰度下降。聚光器與物鏡配合的操作方法是：在完成照明、調(diào)焦操作后，取下目鏡直接向鏡筒中看，把聚光器下的可變光闌關(guān)到*小，再慢慢地開大。開到它的口徑與所見視場(chǎng)的直徑恰好一樣大*，然后按上目鏡，即可進(jìn)行觀察。每轉(zhuǎn)換一次物鏡，都要隨著進(jìn)行依次這樣的配合操作。有的聚光器可變光闌的邊框上刻有表示開啟口徑的尺度，可以根據(jù)刻度來(lái)進(jìn)行配合。

　　*注意：如果是老師用的帶有孔徑光闌而不是光圈的顯微鏡，應(yīng)該將孔徑光闌的數(shù)值孔徑（注意，不是鏡頭的物理直徑尺寸）調(diào)整為物鏡的數(shù)值孔徑（見物鏡上正中標(biāo)示，如10×物鏡可為0.30等）的80%，可以在*大分辨率與*大反差之間取得*好的平衡。

　　歷史上顯微鏡的發(fā)明和顯微鏡的每一次創(chuàng)新都給人類的認(rèn)知帶來(lái)了飛躍式的發(fā)展；給人類的生活帶來(lái)了空前的拓展。在提倡科技創(chuàng)新的今天，顯微鏡的使用已經(jīng)成為中學(xué)生的一項(xiàng)基本技能，掌握結(jié)構(gòu)，科學(xué)使用，良好維護(hù)，使之成為廣大青少年探索未來(lái)世界的一個(gè)窗口。

　　光學(xué)原理

　　顯微鏡是利用凸透鏡的放大成像原理，將人眼不能分辨的微小物體放大到人眼能分辨的尺寸，其主要是增大近處微小物體對(duì)眼睛的張角（視角大的物體在視網(wǎng)膜上成像大），用角放大率M表示它們的放大本領(lǐng)。因同一件物體對(duì)眼睛的張角與物體離眼睛的距離有關(guān)，所以一般規(guī)定像離眼睛距離為25厘米（明視距離）處的放大率為儀器的放大率。顯微鏡觀察物體時(shí)通常視角甚小，因此視角之比可用其正切之比代替。

　　顯微鏡由兩個(gè)會(huì)聚透鏡組成，光路圖如圖所示。物體AB經(jīng)物鏡成放大倒立的實(shí)像A1B1，A1B1位于目鏡的物方焦距的內(nèi)側(cè)，經(jīng)目鏡后成放大的虛像A2B2于明視距離處。

　　配件

　　隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和人們對(duì)顯微鏡要求的提高，單一的光學(xué)顯微成像系統(tǒng)已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們顯微攝影的要求。數(shù)碼顯微鏡的面市，標(biāo)志著光學(xué)顯微鏡從此進(jìn)入到一個(gè)新的數(shù)碼時(shí)代。數(shù)碼顯微鏡不僅結(jié)合了光學(xué)顯微鏡良好的成像特點(diǎn)，更將其與先進(jìn)的光電轉(zhuǎn)換技術(shù)、液晶屏幕技術(shù)**地結(jié)合，使顯微鏡在具有顯微觀察本領(lǐng)的同時(shí)，更實(shí)現(xiàn)了顯微圖像的數(shù)字化存儲(chǔ)和傳輸。

　　然而，數(shù)碼顯微鏡高昂的成本并沒(méi)有使其得到廣泛的應(yīng)用，一種新型的顯微數(shù)碼產(chǎn)品——顯微數(shù)字?jǐn)z像頭也隨之產(chǎn)生。顯微數(shù)字?jǐn)z像頭作為一種專用的顯微數(shù)字相機(jī)，能夠方便地鏈接到任意的顯微鏡上，實(shí)現(xiàn)光學(xué)顯微鏡向數(shù)碼顯微鏡的轉(zhuǎn)化。

　　作為光學(xué)顯微鏡的必備配件，顯微數(shù)字?jǐn)z像頭也根據(jù)不同的需要分為很多個(gè)不同的等級(jí)，有的比較適合對(duì)圖像的要求比較高的，有的比較適合一般化的需求。作為一種方便快捷的顯微攝像系統(tǒng)，顯微數(shù)字?jǐn)z像頭將得到極大的應(yīng)用。

　　光學(xué)顯微鏡的配件有目鏡物鏡和光源等等，當(dāng)然隨著科技的發(fā)展，光學(xué)顯微鏡逐漸也配備了攝像系統(tǒng)，這樣就可以在顯示器上顯示出來(lái)了，觀看的時(shí)候也比較方便了。

　　另外光源顯微鏡的光源也比較重要，配備的時(shí)候光源有環(huán)形光源也有，夾式的光源。

　　 光學(xué)顯微鏡的底座也不盡相同，有的是塑料材質(zhì)的，有的是合金的，好一點(diǎn)的是合金的材質(zhì)，合金的不容易變形。放大的倍數(shù)也不大一樣，有的可以連續(xù)變倍，有的只有一個(gè)倍數(shù)，或者兩個(gè)倍數(shù)。

　　分類

　　光學(xué)顯微鏡有多種分類方法，按使用目鏡的數(shù)目可分為三目，雙目和單目顯微鏡；按圖像是否有立體感可分為立體視覺(jué)和非立體視覺(jué)顯微鏡；按觀察對(duì)像可分為生物和金相顯微鏡等；按光學(xué)原理可分為偏光，相襯和微分干涉對(duì)比顯微鏡等；按光源類型可分為普通光、熒光、紅外光和激光顯微鏡等；按接收器類型可分為目視、攝影和電視顯微鏡等。常用的顯微鏡有雙目連續(xù)變倍體視顯微鏡、金相顯微鏡、偏光顯微鏡、紫外熒光顯微鏡等。

　　雙目體視顯微鏡是利用雙通道光路，為左右兩眼提供一個(gè)具有立體感的圖像。它實(shí)質(zhì)上是兩個(gè)單鏡筒顯微鏡并列放置，兩個(gè)鏡筒的光軸構(gòu)成相當(dāng)于人們用雙目觀察一個(gè)物體時(shí)所形成的視角，以此形成三維空間的立體視覺(jué)圖像。雙目體視顯微鏡在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛用于切片操作和顯微外科手術(shù)；在工業(yè)中用于微小零件和集成電路的觀測(cè)、裝配、檢查等工作。

　　金相顯微鏡是專門用于觀察金屬和礦物等不透明物體金相組織的顯微鏡。這些不透明物體無(wú)法在普通的透射光顯微鏡中觀察，故金相和普通顯微鏡的主要差別在于前者以反射光，而后者以透射光照明。在金相顯微鏡中照明光束從物鏡方向射到被觀察物體表面，被物面反射后再返回物鏡成像。這種反射照明方式也廣泛用于集成電路硅片的檢測(cè)工作。

　　紫外熒光顯微鏡是用紫外光激發(fā)熒光來(lái)進(jìn)行觀察的顯微鏡。某些標(biāo)本在可見光中覺(jué)察不到結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，但經(jīng)過(guò)染色處理，以紫外光照射時(shí)可因熒光作用而發(fā)射可見光，形成可見的圖像。這類顯微鏡常用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中。

　　電視顯微鏡和電荷耦合器顯微鏡是以電視攝像靶或電荷耦合器作為接收元件的顯微鏡。在顯微鏡的實(shí)像面處裝入電視攝像靶或電荷耦合器取代人眼作為接收器，通過(guò)這些光電器件把光學(xué)圖像轉(zhuǎn)換成電信號(hào)的圖像，然后對(duì)之進(jìn)行尺寸檢測(cè)、顆粒計(jì)數(shù)等工作。這類顯微鏡的可以與計(jì)算機(jī)聯(lián)用，這便于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)和信息處理的自動(dòng)化，多應(yīng)用于需要進(jìn)行大量繁瑣檢測(cè)工作的場(chǎng)合。

　　掃描顯微鏡是成像光束能相對(duì)于物面作掃描運(yùn)動(dòng)的顯微鏡 。在掃描顯微鏡中依靠縮小視場(chǎng)來(lái)保證物鏡達(dá)到*高的分辨率，同時(shí)用光學(xué)或機(jī)械掃描的方法，使成像光束相對(duì)于物面在較大視場(chǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，并用信息處理技術(shù)來(lái)獲得合成的大面積圖像信息。這類顯微鏡適用于需要高分辨率的大視場(chǎng)圖像的觀測(cè)。粗準(zhǔn)焦螺旋：大范圍上下調(diào)動(dòng)鏡筒。

　　細(xì)準(zhǔn)焦螺旋：小范圍上下調(diào)動(dòng)鏡筒。

　　調(diào)試

　　照明光路系統(tǒng)的調(diào)整

　　為了使顯微鏡的視野能受到均勻而又充分的照明，在顯微鏡初次安裝和調(diào)試時(shí)，就必須把照明光路系統(tǒng)調(diào)整好，這是正確使用顯微鏡，并獲得正確、可*結(jié)果的重要手段和*基本的要求。此外，正確掌握照明光路系統(tǒng)的調(diào)整，是使用顯微鏡過(guò)程中更換光源燈泡后所必經(jīng)的步驟，也是在日常使用過(guò)程中不時(shí)地檢驗(yàn)顯微鏡性能的必要手段。顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整主要有以下4項(xiàng)內(nèi)容：

　　1．照明光源燈室在顯微外的初步調(diào)整

　?、?首先將燈室的外殼打開，壓彈簧夾子將鹵素?zé)襞菅b入插座中，安裝時(shí)避免手指直接接觸燈泡（可用柔軟的布或紙隔?。悦鉄襞萆狭粲兄讣y等臟物，影響燈泡的使用壽命。

　?、诎褵羰覕[在桌面上，接通電源后，用專用的螺絲刀調(diào)節(jié)燈的調(diào)焦旋鈕孔（標(biāo)有“←→”），使燈絲投影在1-2m外的墻上，將燈絲成像調(diào)至清晰；然后調(diào)節(jié)燈的高低位置調(diào)節(jié)絲孔（標(biāo)有“──”），使燈絲位置高低適當(dāng)；再調(diào)節(jié)燈的左右位置調(diào)節(jié)螺絲孔（標(biāo)有“──”），使燈絲左右位置合適。

　　2．光源發(fā)光體（燈絲）在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗(yàn)和校正

　　目的是為了把發(fā)光體的像端端正正地調(diào)入物鏡的視域范圍內(nèi)，從光源的角度去確保顯微鏡的視域受到充分而均勻的照明，這是調(diào)整庫(kù)勒照明系統(tǒng)的前提條件。需要的基本工具：對(duì)中望遠(yuǎn)鏡購(gòu)置顯微鏡時(shí)已配備。

　?、?拔掉燈庫(kù)內(nèi)的毛玻璃套筒，把燈室裝回顯微鏡上

　?、谶x用10×物鏡，開亮光源程序找樣品并調(diào)焦清晰，再換用40×物鏡把樣品調(diào)焦清晰（40×物鏡可以看清燈絲的全貌）；

　　③把聚光鏡的孔徑光闌和視場(chǎng)光闌均開到*大；

　?、馨蔚羝渲幸粋€(gè)目鏡，換上對(duì)中望遠(yuǎn)鏡，抓住白色部分，另一手伸縮黑色接目鏡，就可在視野中看到燈絲像；

　?、萑鐭艚z位置不合適，調(diào)“──”孔，把燈絲像沿水平方向調(diào)好，調(diào)“──”孔，把絲像沿垂直方向調(diào)好，直至將燈絲像調(diào)至剛好充滿物鏡孔徑的光圓像；

　?、拚{(diào)整完畢后，將毛玻璃套筒插回原位，拔掉對(duì)中望遠(yuǎn)鏡，換回目鏡作下一步調(diào)整。以上所述照明光源燈室在顯微鏡外的調(diào)整和光源發(fā)光體在顯微鏡內(nèi)位置的校驗(yàn)，只需在顯微鏡初次安裝調(diào)試及更換燈泡時(shí)進(jìn)行，平時(shí)使用顯微鏡時(shí)不能隨意亂調(diào)亂動(dòng)。萬(wàn)一調(diào)亂時(shí)，可按上述步驟調(diào)回原狀。

　　3．庫(kù)勒照明（Kohler）系統(tǒng)的正確調(diào)整

　　顯微鏡的正確調(diào)試，主要工作之一是照明光路系統(tǒng)的調(diào)整，而其中的關(guān)鍵是庫(kù)勒照明系統(tǒng)的調(diào)整。對(duì)于每一位使用顯微鏡的人員，特別是作顯微照像的人員來(lái)說(shuō)，應(yīng)該對(duì)庫(kù)勒照明系統(tǒng)的原理及其調(diào)整步驟有一定的了解和掌握，才能充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的功能，拍出來(lái)的照片才能在效果上比較一致而又完善。庫(kù)勒照明系統(tǒng)的原理簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是：光源發(fā)光體上任意一點(diǎn)發(fā)出的光，可以照明顯微鏡的視域范圍，而光源發(fā)光體上每一點(diǎn)所發(fā)出的光匯集起來(lái)，在顯微鏡的視域中就實(shí)現(xiàn)了非常充分而又均勻的照明。調(diào)整庫(kù)勒照明系統(tǒng)的目的，是為了使所觀察的視域能獲得均勻而又充分的照明，防止雜散光對(duì)照像系統(tǒng)造成影響或干擾，以免照像時(shí)在底片形成灰霧。高調(diào)整庫(kù)勒照明系統(tǒng)的必要部件：視場(chǎng)光闌、可進(jìn)行合軸調(diào)整的聚光鏡系統(tǒng)。

　　① 選用10×物鏡和10×目鏡

　?、?把聚光鏡前端透鏡擺進(jìn)光路中，孔徑光闌調(diào)至適中的位置上（不大不?。?，再把聚光鏡升到*頂?shù)奈恢蒙?，聚光鏡轉(zhuǎn)盤調(diào)至明視野“J”位置

　?、?把視場(chǎng)光闌調(diào)至*?。?.1）

　?、?載物臺(tái)上放上已封片的生物樣品，開亮光源，調(diào)焦清晰

　?、?視域中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)局部照明的區(qū)域或亮斑，這是視場(chǎng)光闌的模糊像，在其中可以清晰地看到樣品的細(xì)節(jié)；在它之外是較暗的視域，不一定能把樣品的細(xì)節(jié)看得清楚

　?、薨丫酃忡R微微地向下調(diào)，使視野中的亮斑逐漸收小，慢慢變成一個(gè)清晰的多邊形象，這便是視場(chǎng)光闌的清晰像；

　?、咭话闱闆r下，多邊形象并不在視域中央，需要調(diào)整聚光鏡的一對(duì)調(diào)中螺絲，把視場(chǎng)光闌多邊形的像調(diào)至中央位置；

　?、嘀饾u開大視場(chǎng)光闌，使多邊形象成為視域的內(nèi)接多邊形，進(jìn)一步核對(duì)調(diào)中的狀況，如對(duì)中不夠理想，繼續(xù)微微調(diào)對(duì)中螺絲；

　?、釋⒁晥?chǎng)光闌稍為再微微開大一些，使它的多邊形象恰好消失在視域的邊緣上，至此，庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整完畢。庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整好以后，整個(gè)視域照明均勻，拍攝的顯微照片明亮清晰，反差正常。在日后使用過(guò)程中應(yīng)特別注意： a. 視場(chǎng)光闌不可任意開大，但可隨物鏡倍數(shù)的增大而將視場(chǎng)光闌收小，隨物鏡倍數(shù)的減小而開大； b. 聚光鏡的高低位置不準(zhǔn)亂調(diào)，否則會(huì)破壞已調(diào)整好的庫(kù)勒照明系統(tǒng)； c. 使用10×以下物鏡時(shí)要將聚光鏡前端透鏡擺出光路外，使用10×或10×以上物鏡時(shí)要將前端透鏡擺入光路中； d. 關(guān)于物鏡倍數(shù)與視場(chǎng)光闌大小配合問(wèn)題，在實(shí)際使用過(guò)程中，作為一般觀察不一定要收小或開大視場(chǎng)光闌，但作顯微照相時(shí)，為了避免雜散光線對(duì)照相系統(tǒng)的干擾，以便能拍攝到較完善的照片，則應(yīng)在使用每一個(gè)倍數(shù)的物鏡時(shí)，把視場(chǎng)光闌調(diào)節(jié)到正好消失于所觀察的視域邊上，這是比較繁復(fù)的工作，但又非做不可。較為簡(jiǎn)便的方法是把與各個(gè)倍數(shù)物鏡相對(duì)應(yīng)的視場(chǎng)光闌事先調(diào)整好，并作好記號(hào)，以后使用時(shí)根據(jù)記號(hào)直接調(diào)至相應(yīng)的位置。

　　4．孔徑光闌的正確使用

　　由于聚光鏡的孔徑光闌可以影響顯微鏡的分辨率，使用時(shí)應(yīng)掌握正確的使用方法。過(guò)去由于對(duì)孔徑光闌的認(rèn)識(shí)不足，往往把它當(dāng)作是調(diào)節(jié)視野亮度的工具。雖然調(diào)節(jié)孔徑光闌在一定程度上可以改變視野的亮度，但會(huì)直接影響成像的反差、對(duì)比度及分辨率，在使用過(guò)程中應(yīng)盡可能避免。為了發(fā)揮聚光鏡孔徑光闌的作用，以便在觀察時(shí)，尤其在作顯微照相時(shí)獲得*佳分辨率，在每換用一個(gè)倍數(shù)的物鏡時(shí)，在樣品調(diào)焦清晰后，需要調(diào)節(jié)孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑（物鏡孔徑像）的2/3 。調(diào)整方法是用對(duì)中望遠(yuǎn)鏡對(duì)焦于視野中黑色相差環(huán)上，調(diào)節(jié)孔徑光闌，可以看到一個(gè)多邊形的孔徑光闌像，然后調(diào)到等于物鏡孔徑像的2/3，即介于黑色相差環(huán)外與圓形視域內(nèi)之間。為方便起見，可把與各倍數(shù)物鏡相對(duì)應(yīng)的孔徑光闌預(yù)先調(diào)整好，并作好標(biāo)記，以免每次使用都要重新調(diào)整。

　　成像光路系統(tǒng)的調(diào)整及顯微鏡檢術(shù)概要

　　顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整，是根據(jù)不同顯微鏡檢術(shù)的需要而進(jìn)行的。所謂顯微鏡檢術(shù)（microscopy），概括而言就是以顯微鏡觀察樣品時(shí)所使用的照明方法，以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術(shù)與方法。以下簡(jiǎn)述顯微鏡檢術(shù)中已成熟的幾種方法及對(duì)應(yīng)的顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整方法。

　　1．透射光明視野：

　　這是自顯微鏡發(fā)明以來(lái)*傳統(tǒng)、*普遍的應(yīng)用方法?；静考?a. 物鏡：任何物鏡都可作明視野觀察； b. 聚光鏡：各種聚光鏡均可，*好配有孔徑光闌。調(diào)整方法：在上述顯微鏡的庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整好后，即可應(yīng)用明視野法。適用范圍：所有已染色的組織切片、血液涂片等。注意事項(xiàng)： a. 使用明視野方法觀察時(shí)，一定要將庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整好； b. 視場(chǎng)光闌不可任意開大，使用10×、10×以下和10×以上物鏡時(shí)，要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實(shí)出和擺進(jìn)光路中； c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來(lái)調(diào)節(jié)視野的亮度，更不要亂調(diào)聚光鏡的高低位置，否則，會(huì)降低顯微鏡的分辨率和破壞已調(diào)整好的庫(kù)勒 照明系統(tǒng)； d. 作顯微照相時(shí)，每換用一個(gè)倍數(shù)的物鏡，就要調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑的2/3 。

　　2．透射光相差法：

　　這是現(xiàn)代顯微鏡檢術(shù)中的一種反差增強(qiáng)法。基本部件：相差物鏡、明視野與相差兼用的多用途聚光鏡、對(duì)中望遠(yuǎn)鏡、綠色濾光片。

　　調(diào)整方法：

　　a. 在庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整好的基礎(chǔ)上，用明視野方法把樣品調(diào)焦清晰

　　b. 把聚光鏡轉(zhuǎn)到Ph1對(duì)準(zhǔn)轉(zhuǎn)盤刻度線位置，選用10×相差物鏡，換上待觀察的透明樣品

　　c. 拔掉其中一個(gè)目鏡，換上對(duì)中望遠(yuǎn)鏡，并調(diào)焦于視野中的兩個(gè)相差環(huán)上（物鏡的黑色相差環(huán)和聚光鏡的透光相差環(huán)）

　　d. 視野中的兩個(gè)相差環(huán)不一定重合，調(diào)節(jié)聚光鏡上的兩個(gè)調(diào)節(jié)裝置（調(diào)整相差環(huán)左右位置的調(diào)節(jié)桿和調(diào)整前后位置的摩擦式轉(zhuǎn)鈕），使透光環(huán)作前后左右移動(dòng)而與黑環(huán)重合

　　e. 調(diào)整好后，換回觀察用目鏡，將綠色濾光片按入光路中，即可觀察到樣品的相差像

　　f. 有20×和40×物鏡觀察時(shí)，聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph2位置上，用100物鏡時(shí)，聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph3位置上。

　　適用范圍：適用于觀察透明、未染色或不能染色的樣品，如各種細(xì)胞、活組織、未染色或不染色的組織切片、水生生物等。

　　3．微分干涉相襯法：

　　為了克服相差法觀察時(shí)樣品細(xì)節(jié)像周圍伴隨有光暈，會(huì)掩沒(méi)掉本來(lái)應(yīng)該看見的細(xì)節(jié)，以及樣品或組織切片厚度要求相當(dāng)薄，原則上下能厚于10?m等局限性，利用雙光束干涉的原理設(shè)計(jì)子微分干涉相襯法。

　　調(diào)整方法：

　　a. 必須在庫(kù)勒明系統(tǒng)已調(diào)好的基礎(chǔ)上才能調(diào)好DIC方法

　　b. 先用10×物鏡，以明視野先確定好能把樣品看清晰的物鏡調(diào)焦位置

　　c. 把起偏器（polarizer）擺入照明光路中，注意其取向應(yīng)為東—西方向

　　d. 把聚光鏡轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)到與10×物鏡對(duì)應(yīng)使用的位置上，即DIC 0.3—0.4

　　e. 在物鏡后方或物鏡轉(zhuǎn)換器上插入10×物鏡使用的DIC插片（DIC slider）

　　f. 把檢偏器（analyser）插入成像光路中，注意其取向應(yīng)為南—北方

　　g. 換上待觀察的透明樣品，開亮光源把樣品調(diào)焦清晰

　　h. 調(diào)節(jié)DIC插片，使微分干涉相襯的像達(dá)到*佳效果，也就是浮雕效果*為明顯

　　i. 同時(shí)可調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使反差的效果也達(dá)到*佳

　　j. 然后再細(xì)微調(diào)樣品的細(xì)節(jié)，可見樣品中不同層面上的結(jié)構(gòu)

　　k. 如果把補(bǔ)色器（first order red retardation plate）插入，并同時(shí)調(diào)節(jié)DIC插片，可在視野中看到不斷變化的絢麗色彩，紅、橙、黃、綠、藍(lán)、紫、粉紅、粉紫及金黃色都具有。適用范圍：透明或不能染色的組織切片，厚度可達(dá)100?m左右，培養(yǎng)中的活組織和活細(xì)胞、小生生物等。

　　4．落射光激發(fā)的熒光法（incident-loght fluorescence Epi-FL）：

　　簡(jiǎn)稱為落射熒光法，是近代顯微鏡檢術(shù)中新發(fā)展出來(lái)的一種強(qiáng)有力的反差增強(qiáng)法。它將激發(fā)熒光用的光源改在物鏡的上方，光由物鏡上方經(jīng)反光鏡射入物鏡去激發(fā)樣品，從樣品上被激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡(jiǎn)便，效率高，50W的光源強(qiáng)度比透射熒光法的250W還強(qiáng)。熒光方法是利用波長(zhǎng)較短的紫外光、紫光、藍(lán)紫光、藍(lán)光及綠光等去激發(fā)樣品，只要樣品中含有可產(chǎn)生熒光的成分，它便吸收短波的激發(fā)光而釋放出波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光。不同物質(zhì)只能吸改特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，而釋放的熒光也會(huì)有特定的波長(zhǎng)，因而用作特異性的鑒定十分有效，如某些致病的細(xì)菌和螺旋體，受紫外光激發(fā)后能發(fā)出它們特有的熒光，很容易作出鑒定，這種利用物質(zhì)吸收激發(fā)光后放出特有熒光的方法稱為自發(fā)熒光法。某些物質(zhì)自身不會(huì)吸收激發(fā)光，或吸收后不能釋放熒光，但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料，而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發(fā)光，再釋放出特定的熒光，從而間接地鑒別出某種物質(zhì)，這稱為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及工業(yè)的特異性研究和鑒別上。調(diào)整方法：熒光顯微鏡或附有熒光部件的顯微鏡，調(diào)整的方法大致相同。

　?、?汞燈的安裝：

　　a. 打開包裝，取出汞燈將其小心安裝在上電極散熱帽上，安裝時(shí)注意手指不能直接接觸燈管和散熱帽的正面，汞燈的封氣口要對(duì)向散熱帽的左側(cè)或右側(cè)

　　b. 把汞燈的上電極引張安裝并固定在散熱帽底面的小孔上，再把汞燈的下電極及上電極引線另一端，分別安裝在燈座上各自的插孔中并固定

　　c. 鎖緊散熱片上的螺絲后，把汞燈連同燈座及散熱帽小心裝入燈室中，鎖緊相應(yīng)的螺絲，再把燈座上的連線和插座插到汞燈電源后部專用的插座上。

　　d. 詳細(xì)的安裝方法請(qǐng)參照有關(guān)說(shuō)明書。

　?、?汞燈燈室在顯微鏡外的初步調(diào)整：

　　a. 接通汞燈電源，讓汞燈預(yù)熱10-15min

　　b. 把汞燈燈室擺放在桌面上，讓汞弧投影到2-3m外的墻上，劃一條與燈室窗口中心線對(duì)地高度一樣的水平線作為參考線

　　c. 轉(zhuǎn)動(dòng)燈室調(diào)焦旋鈕，使汞弧的像清晰地投影于墻上

　　d. 分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個(gè)調(diào)節(jié)螺絲孔，把汞弧的像其反射像調(diào)成并排且盡量*近，但不要重疊在一起。

　?、酃療艄≡陲@微鏡內(nèi)位置的檢驗(yàn)：

　　a. 將汞燈照明光路系統(tǒng)中的視場(chǎng)光闌開到*大

　　b. 把熒光濾光片組推到藍(lán)光激發(fā)的位置上，以避免汞燈中的藍(lán)光太刺眼

　　c. 把觀察的樣品或一塊載玻片放在物臺(tái)上，蓋上一張比蓋玻片稍大且潔白的薄紙

　　d. 取下一個(gè)物鏡，使激發(fā)的藍(lán)光經(jīng)物鏡轉(zhuǎn)換器的空檔照在白紙上，白紙上會(huì)有一藍(lán)色的圓形照明區(qū)域，汞弧的像及其反射像都應(yīng)該出現(xiàn)在這區(qū)域的中央部位，否則，可調(diào)節(jié)燈室調(diào)焦旋鈕至*清晰，然后分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個(gè)調(diào)節(jié)螺絲孔，直至汞弧的像及其反射像并排在照明區(qū)域的中央位置。

　　e. 調(diào)好之后，把物鏡裝回去，通過(guò)目鏡可見白紙被藍(lán)光激發(fā)后發(fā)射出的黃綠色熒光

　　f. 仔細(xì)調(diào)焦，可看清白紙的纖維；取去白紙，樣品上的熒光細(xì)節(jié)隱約可見而很容易調(diào)焦清晰。

　　④汞燈使用注意事項(xiàng)

　　通常使用的為50W超高氣壓汞燈，燈管內(nèi)通有一對(duì)鎢電極和液態(tài)汞（室溫下附在管壁上），未點(diǎn)燃時(shí)，管內(nèi)氣壓很低，在燈管的兩電極間施加電壓角發(fā)點(diǎn)燃后，汞氣化為汞蒸氣形成汞弧而產(chǎn)生強(qiáng)光，溫度升高，管內(nèi)氣壓迅速升到10個(gè)大氣壓。由于是高氣壓的氣體放電，必須了解其特性才能安全地使用汞燈。

　　a. 汞燈接通電源后需要10-15min預(yù)熱時(shí)間，汞才能充分汽化并形成汞弧，產(chǎn)生高亮度而穩(wěn)定的激發(fā)光。因此，觀察前要提早通電

　　b. 汞燈在使用過(guò)程中，不要隨意開關(guān)汞燈的電源

　　c. 關(guān)掉汞燈電源后，必須等待15-20min，待汞燈自燃冷卻后才可再次接通電源，違反這一操作規(guī)定時(shí)，將會(huì)造成嚴(yán)重后果！由于汞燈內(nèi)的汞蒸氣未完全液化，汞蒸氣內(nèi)阻很小，一旦通電在兩電極間施加電壓，汞燈內(nèi)形成強(qiáng)大的電流，輕則燒斷保險(xiǎn)絲或燒毀汞燈電源中的扼流圈，重則汞燈爆炸，汞蒸氣彌漫整個(gè)實(shí)驗(yàn)室，造成工作人員中毒，不僅損失了汞燈，還會(huì)炸毀燈室內(nèi)的集光-聚光部件。

　　d. 汞燈的使用壽命一般只有300h，使用得當(dāng)可達(dá)600h，使用壽命與開關(guān)的次數(shù)成反比，應(yīng)集中一批樣呂作2-3h的觀察。汞燈價(jià)格及昂貴，應(yīng)珍惜使用。

　　e. 汞燈壽命終結(jié)的標(biāo)志是點(diǎn)燃困難，燈管發(fā)黑。

　　5．暗視野法（dark field）：

　　許多透明或半透明的樣品，如細(xì)菌、微生物、細(xì)胞內(nèi)的精細(xì)結(jié)構(gòu)及結(jié)晶體的內(nèi)含物等，在明視野顯微鏡中不容易看清楚，如果采用暗視野法就可以大大提高樣品的可視度。以暗視野法所看到的是襯托在黑暗視野背景中發(fā)亮的樣品輪廓及其細(xì)節(jié)。普遍光學(xué)顯微鏡的*高分辨率為0.2μm，而暗視野顯微鏡雖然對(duì)樣品的細(xì)節(jié)構(gòu)造分辨不清楚，但卻可看到0.004μm以上微細(xì)顆粒的存在，即可以看到亞顯微結(jié)構(gòu)，特別適合用來(lái)觀察微細(xì)的顆粒與細(xì)菌等。調(diào)整方法：暗視野法的主要必需部件是暗視野聚光鏡。使用時(shí)須先用明視野聚光鏡把庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整好。換上暗視野聚光鏡時(shí)，要把載玻片（樣品）移開，將浸沒(méi)油滴在聚光鏡頂部，再把樣品載玻片擱在物臺(tái)上，浸沒(méi)油便充填在兩者之間，這種聚光鏡須與裝有可變光闌的100×油鏡配用。另一種中倍率干式暗視野聚光鏡可與中倍率的物鏡配用，這種聚光鏡具有中央光擋，照明光只能透過(guò)光檔與聚光鏡邊緣之間的透光環(huán)才能進(jìn)入聚光鏡內(nèi)。對(duì)于配備齊全的相差顯微鏡，與編號(hào)為Ph3物鏡配用的相差聚光鏡相差環(huán)，可以和10×及10×以下的相差物鏡配用而形成低倍率的暗視野效果。

　　使用規(guī)程

　?。ㄒ唬?shí)驗(yàn)時(shí)要把顯微鏡放在桌面上稍偏左的位置，鏡座應(yīng)距桌沿 6～7 cm左右。

　?。ǘ┐蜷_光源開關(guān)，調(diào)節(jié)光強(qiáng)到合適大小。

　　（三）轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡頭正對(duì)載物臺(tái)上的通光孔。先把鏡頭調(diào)節(jié)至距載物臺(tái)1～2cm左右處，然后用左眼注視目鏡內(nèi)，接著調(diào)節(jié)聚光器的高度，把孔徑光闌調(diào)至*大，使光線通過(guò)聚光器射入到鏡筒內(nèi)，這時(shí)視野內(nèi)呈明亮的狀態(tài)。

　?。ㄋ模⑺^察的玻片放在載物臺(tái)上，使玻片中被觀察的部分位于通光孔的正中央，然后用標(biāo)本夾夾好載玻片。

　?。ㄎ澹┫扔玫捅剁R觀察（物鏡10X、目鏡10x）。觀察之前，先轉(zhuǎn)動(dòng)粗動(dòng)調(diào)焦手輪，使載物臺(tái)上升，物鏡逐漸接近玻片。需要注意，不能使物鏡觸及玻片，以防鏡頭將玻片壓碎。然后，左眼注視目鏡內(nèi)，同時(shí)右眼不要閉合（要養(yǎng)成睜開雙眼用顯微鏡進(jìn)行觀察的習(xí)慣，以便在觀察的同時(shí)能用右眼看著繪圖），并轉(zhuǎn)動(dòng)粗動(dòng)調(diào)焦手輪，使載物臺(tái)慢慢下降，不久即可看到玻片中材料的放大物像。

　?。┤绻谝曇皟?nèi)看到的物像不符合實(shí)驗(yàn)要求（物像偏離視野），可慢慢調(diào)節(jié)載物臺(tái)移動(dòng)手柄。調(diào)節(jié)時(shí)應(yīng)注意，玻片移動(dòng)的方向與視野中看到的物像移動(dòng)的方向，正好相反。如果物像不甚清晰，可以調(diào)節(jié)微動(dòng)調(diào)焦手輪，直至物像清晰為止。

　?。ㄆ撸┮话憔哂姓９δ艿娘@微鏡，低倍物鏡和高倍物鏡基本齊焦，在用低倍物鏡觀察清晰時(shí)，換高倍物鏡應(yīng)可以見到物像，但物像不一定很清晰，可以轉(zhuǎn)動(dòng)微動(dòng)調(diào)焦手輪進(jìn)行調(diào)節(jié)。

　?。ò耍┰谵D(zhuǎn)換高倍物鏡并且看清物像之后，可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)孔徑光闌的大小或聚光器的高低，使光線符合要求（一般將低倍物鏡換成高倍物鏡觀察時(shí)，視野要稍變暗一些，所以需要調(diào)節(jié)光線強(qiáng)弱）。

　?。ň牛┯^察完畢，應(yīng)先將物鏡鏡頭從通光孔處移開，然后將孔徑光闌調(diào)至*大，再將載物臺(tái)緩緩落下，并檢查零件有無(wú)損傷（特別要注意檢查物鏡是否沾水沾油，如沾了水或油要用鏡頭紙擦凈），檢查處理完畢后即可裝箱。

　　維護(hù)內(nèi)容

　?。ㄒ唬┍仨毷炀氄莆詹?yán)格執(zhí)行使用規(guī)程,按照嚴(yán)格的流程和說(shuō)明書來(lái)操作顯微鏡。

　?。ǘ┤∷惋@微鏡時(shí)一定要一手握住彎臂，另一手托住底座。顯微鏡不能傾斜，以免目鏡從鏡筒上端滑出。取送顯微鏡時(shí)要輕拿輕放。

　　（三）觀察時(shí)，不能隨便移動(dòng)顯微鏡的位置。

　?。ㄋ模┓彩秋@微鏡的光學(xué)部分，只能用特殊的擦鏡頭紙擦拭，不能亂用他物擦拭，更不能用手指觸摸透鏡，以免汗液玷污透鏡。

　?。ㄎ澹┍３诛@微鏡的干燥、清潔，避免灰塵、水及化學(xué)試劑的玷污。

　?。┺D(zhuǎn)換物鏡鏡頭時(shí)，不要搬動(dòng)物鏡鏡頭，只能轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器。

　?。ㄆ撸┣形痣S意轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)焦手輪。使用微動(dòng)調(diào)焦旋鈕時(shí)，用力要輕，轉(zhuǎn)動(dòng)要慢，轉(zhuǎn)不動(dòng)時(shí)不要硬轉(zhuǎn)。

　　（八）不得任意拆卸顯微鏡上的零件，嚴(yán)禁隨意拆卸物鏡鏡頭，以免損傷轉(zhuǎn)換器螺口，或螺口松動(dòng)后使低高倍物鏡轉(zhuǎn)換時(shí)不齊焦。

　?。ň牛┦褂酶弑段镧R時(shí)，勿用粗動(dòng)調(diào)焦手輪調(diào)節(jié)焦距，以免移動(dòng)距離過(guò)大，損傷物鏡和玻片。

　?。ㄊ┯卯吽瓦€前，必須檢查物鏡鏡頭上是否沾有水或試劑，如有則要擦拭干凈，并且要把載物臺(tái)擦拭干凈，然后將顯微鏡放人箱內(nèi)，并注意鎖箱。

　　(十一）顯微鏡的保存*好在干燥、清潔的環(huán)境中，避免灰塵以及化學(xué)品玷污。

　　注意事項(xiàng)

　　一、正確安裝的問(wèn)題

　　使用顯微鏡前，首先要把顯微鏡的目鏡和物鏡安裝上去。目鏡的安裝極為簡(jiǎn)單，主要的問(wèn)題在于物鏡的安裝，由于物鏡鏡頭較貴重，萬(wàn)一學(xué)生安裝時(shí)螺紋沒(méi)合好，易摔到地上，造成鏡頭損壞，所以為了保險(xiǎn)起見，強(qiáng)調(diào)學(xué)生安裝物鏡時(shí)用左手食指合中指托住物鏡，然后用右手將物鏡裝上去，這樣即使沒(méi)安裝好，也不會(huì)摔到地上。

　　二、正確對(duì)光的問(wèn)題

　　對(duì)光是使用顯微鏡時(shí)很重要的一步，有些學(xué)生在對(duì)光時(shí)，隨便轉(zhuǎn)一個(gè)物鏡對(duì)著通光孔，而不是按要求一定用低倍鏡對(duì)光。轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡時(shí)喜歡用一只手，往往將反光鏡扳了下來(lái)。所以教師在指導(dǎo)學(xué)生時(shí)，一定要強(qiáng)調(diào)用低倍鏡對(duì)光，當(dāng)光線較強(qiáng)時(shí)用小光圈，平面鏡，而光線較弱時(shí)則用大光圈，凹面鏡，反光鏡要用雙手轉(zhuǎn)動(dòng)，當(dāng)看到均勻光亮的圓形視野為止。光對(duì)好后不要隨便的移動(dòng)顯微鏡，以免光線不能準(zhǔn)確的通過(guò)反光鏡進(jìn)入通光孔。

　　三、正確使用準(zhǔn)焦螺旋的問(wèn)題

　　使用準(zhǔn)焦螺旋調(diào)節(jié)焦距，找到物象可以說(shuō)是顯微鏡使用中*重要的一步，也是學(xué)生感覺(jué)*為困難的一步。學(xué)生在操作中極易出現(xiàn)以下錯(cuò)誤：一是在高倍鏡下直接調(diào)焦；二是不管鏡筒上升或下降，眼睛始終在目鏡中看視野；三是不了解物距的臨界值，物距調(diào)到2～3厘米時(shí)還在往上調(diào)，而且轉(zhuǎn)動(dòng)準(zhǔn)焦螺旋的速度很快。前兩種錯(cuò)誤結(jié)果往往造成物鏡鏡頭抵觸到裝片，損傷裝片或鏡頭，而第三種錯(cuò)誤則是學(xué)生使用顯微鏡時(shí)*常見的一種現(xiàn)象。針對(duì)以上錯(cuò)誤，教師一定要向?qū)W生強(qiáng)調(diào)，調(diào)節(jié)焦距一定要在低倍鏡下調(diào)，先轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，使鏡筒慢慢下降，物鏡靠近載玻片，但注意不要讓物鏡碰到載玻片，在這個(gè)過(guò)程中眼睛要從側(cè)面看物鏡，然后用左眼朝目鏡內(nèi)注視，并慢慢反向調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋，使鏡筒緩緩上升，直到看到物像為止，同時(shí)向?qū)W生說(shuō)明一般顯微鏡的物距在1厘米左右，所以如果物距已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)1厘米，但仍未看到物象，那可能是標(biāo)本未在視野內(nèi)或轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋過(guò)快，此時(shí)應(yīng)調(diào)整裝片位置，然后再重復(fù)上述步驟，當(dāng)視野中出現(xiàn)模糊的物象時(shí)，就要換用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋調(diào)節(jié)，只有這樣，才能縮小尋找范圍，提高找到物象的速度。

　　四、物鏡轉(zhuǎn)換的問(wèn)題

　　使用低倍鏡后換用高倍鏡，學(xué)生往往喜歡用手指直接推轉(zhuǎn)物鏡，認(rèn)為這樣比較省力，但這樣容易使物鏡的光軸發(fā)生偏斜，原因是轉(zhuǎn)換器的材料質(zhì)地較軟，精度較高，螺紋受力不均勻很容易松脫。一旦螺紋破壞，整個(gè)轉(zhuǎn)換器就會(huì)報(bào)廢。教師應(yīng)指導(dǎo)學(xué)生手握轉(zhuǎn)換器的下層轉(zhuǎn)動(dòng)扳轉(zhuǎn)換物鏡。

　　五、光學(xué)玻璃清洗的問(wèn)題

　　光學(xué)玻璃用于儀器的鏡頭、棱鏡、鏡片等。在制造和使用中容易沾上油污、水濕性污物、指紋等，影響成像及透光率。清洗光學(xué)玻璃，應(yīng)根據(jù)污垢的特點(diǎn)、不同結(jié)構(gòu)，選用不同的清洗劑，使用不同的清洗工具，選用不同的清洗方法。清洗鍍有增透膜的鏡頭，如照相機(jī)、幻燈機(jī)、顯微鏡的鏡頭，可用20%左右的酒精和80%左右的乙醚配置清洗劑進(jìn)行清洗。清洗時(shí)應(yīng)用軟毛刷或棉球沾有少量清洗劑，從鏡頭中心向外做圓運(yùn)動(dòng)。切忌把這類鏡頭浸泡在清洗劑中清洗，清洗鏡頭時(shí)不要用力擦拭，否則會(huì)損傷增透膜，損壞鏡頭。

　　清洗棱鏡、平面鏡的方法，可依照清洗鏡頭的方法進(jìn)行。

　　使用上述清洗劑也能清洗光學(xué)玻璃上的油脂性霧、水濕性霧和油水混合性霧，其清洗方法和清洗鏡頭的方法相似。

　　光學(xué)玻璃表面發(fā)霉，是一種常見現(xiàn)象。當(dāng)光學(xué)玻璃生霉后，光線在其表面發(fā)生散射，使成像模糊不清，嚴(yán)重者將使儀器報(bào)廢。光學(xué)玻璃生霉的原因多是因其表面附有微生物孢子，在溫度、濕度適宜，又有所需“營(yíng)養(yǎng)物”時(shí)，便會(huì)快速生長(zhǎng)，形成霉斑。對(duì)光學(xué)玻璃做好防霉防污尤為重要，一旦產(chǎn)生霉斑應(yīng)立即清洗。注意干燥。