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【基本原理】
通常情況下,細胞骨架不穩(wěn)定,如低溫、高壓、饑餓酸處理等。當濃度適當時TritonX-100 在處理細胞時,可溶解質膜結構和細胞中的許多蛋白質,而細胞骨架系統(tǒng)中的蛋白質不被破壞顯得更清晰,M-用緩沖液清洗細胞可以提高細胞骨架的穩(wěn)定性。戊二醛固定可以更好地保存細胞骨架的成分R250 染色后,細胞骨架蛋白可以著色,而細胞背景著色較弱,有利于細胞骨架纖維的顯示。
微絲、微管和中間纖維直徑小,*大的單根微管25nm 只能在電鏡下觀察到。目前,研究細胞骨架的主要方法是應用高壓電鏡或免疫熒光顯微鏡技術。本實驗用普通光鏡觀察細胞骨架,因為骨架纖維的成束分布和結構被染色。因為細胞通過TritonX-100 提取后剩余的主要是細胞骨架成分,使顯示更加清晰。細胞骨架是指細胞質中縱橫交錯的纖維網絡結構,根據成分和形態(tài)結構的不同可分為微管、微絲和中間纖維。它們在維持細胞形態(tài)、生長、運動、分裂、分化和物質運輸方面發(fā)揮著重要作用。Triton X-100 可以溶解細胞膜,保存細胞骨架系統(tǒng)的蛋白質,然后使用考馬斯亮蘭R250 染色使細胞骨架清晰顯現。
【實驗用品】
1材料:新鮮洋蔥鱗莖
2試劑 1) M 緩沖液(pH 7.2)各成分的*終濃度為:
50mmol/L 咪唑(MW:68.08); 50mmol/L KCl(MW:74.55);
0.5mmol/L MgCl2·6H2O(MW:203.30); 1mmol/L EGTA(MW:380.36);
0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24); 1mmol/L DTT(MW:154.3)
2) 6mmol/L PBS 磷酸緩沖液 (pH 6.5):KH2PO4 : Na2HPO4.2H2O = 7:3
3) 0.7% NaCl 生理鹽水
4) 1% Triton X-100 溶于 M-緩沖液
5) 3% 戊二醛100mL: 取25% 戊二醛12mL,PBS 88mL
6) 0.2% 考馬斯亮藍R250 染液 200mL:考馬斯亮藍R250 0.2g;甲醇 46.5mL;冰乙酸 7mL;蒸餾水46.5mL
3儀器:光學顯微鏡、鑷子、剪刀、試管、表面容器、滴管、玻片蓋
方法步驟
【實驗結果】
與內表皮細胞相比(放大倍數)10×20)
附件:各種主要試劑的作用
1.Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用:非離子去垢劑;濃度適當的Triton X-100,細胞膜可以溶解,細胞質中的細胞骨架系統(tǒng)可以保存。
2.M-緩沖液和磷酸緩沖液作用:維持細胞的滲透壓。
3.EDTA(乙二胺四乙酸)和EGTA(乙二醇雙醚四乙酸)作用:前者可螯合大部分金屬離子;后者是專用螯合Ca2+,主要是高濃度Ca2+但是微管解聚,所以加入EGTA 來降低Ca2+的濃度。
4。戊二醛功能:良好的固定劑,使細胞結構保持原狀;
5考馬斯亮蘭功能:非專一性與蛋白質結合,使蛋白質著色(藍色)。
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